DE3942638A1

DE3942638A1 - Anti-aidsviralagenzien und anti-krebsagenzien

Info

Publication number: DE3942638A1
Application number: DE3942638A
Authority: DE
Inventors: Masazumi Yoshihara; Naoki Yamamoto; Masakazu Unten
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-12-26
Filing date: 1989-12-22
Publication date: 1990-07-12
Anticipated expiration: 2009-12-23
Also published as: US5882648A; JP2782443B2; CA2006119C; JPH02172922A; AU644351B2; AU4728989A; CA2006119A1; DE3942638C2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Anti-Aidsviralagens und Anti-Krebsagens, welches Polysaccharide aufweist, die aus Nüssen extrahiert sind. Hauptsächlich von Nußschalen von großen Laubbäumen, die zum Genus (Gattung) Juglans oder dem Genus Cayra des Angiosperms Juglandaceae gehört.

Bislang wurden verschiedene Verbindungen als Anti-Aidsviralagenzien und Anti-Krebsagenzien vorgeschlagen und als Heilmittel entwickelt. Jedoch ist die aktuelle Situation so, daß noch kein durchschlagendes Heilmittel im Hinblick auf die Effekte, Nebeneffekte usw. erhalten wurde.

Die Erfinder haben herausgefunden, daß Substanzen mit einer extrem hohen physiologischen Aktivität in dem Extrakt aus Nußschalen einer Pinie (genus pinus) enthalten sind.

Es wurde durch Virustests und dergleichen eindeutig bestätigt, daß insbesondere Polysaccharide, die in dem Extrakt enthalten sind, Granulocyten in Leucocyten, welche im Blut vorhanden sind, aktivieren können und sie schützten gegen Infektionskrankheiten mit E. coli und verschiedene Viren wie auch den Herpesvirus und gegen Krebs.

Daher haben die Erfinder weiterhin versucht, die wirksame Verbindung aus verschiedenen natürlichen Nußschalen zu extrahieren. Als ein Ergebnis wurde offenbar, daß Polysaccharide gleich den oben genannten Substanzen, welche aus den Piniennußschalen extrahiert sind, auch in dem Extrakt aus Schalen von Nüssen, die zum Genus Juglans oder dem Genus Carya des Angiosperms Juglandaceae gehören, enthalten sind. Es wurde bestätigt, daß die Polysaccharide einen Hemmeffekt auf Virusinfektionen haben. Das heißt, einen Effekt zur Verhinderung des Wucherns des Virus und weiterhin haben sie eine carcinostatische Aktivität gegen Krebs.

Die Erfindung bezieht sich darauf, ein Anti-Aidsviralagens und Anti-Krebsagens vorzusehen, welches Polysaccharide als einen wirksamen Bestandteil aufweist, welche aus Nußschalen von Nüssen, die zum Genus Juglans oder dem Genus Carya des Angiosperms Juglandaceae gehören, extrahiert sind.

Die Fig. 1 und 2 sind Graphen, die die Ergebnisse des Zellenwachstumsverhinderungseffekts und die Cytotoxizität des Extrakts gemäß der Erfindung als ein Anti-Aidsviralagens zeigen. Fig. 3 zeigt die Ergebnisse, welche durch den Test hinsichtlich der carcinostatischen Aktivität erhalten wurden.

Als ein Mittel zum Erreichen des beschriebenen Zieles werden Nußschalen (trockene Schalen), die zum Genus Juglans oder zum Genus Carya des Angiosperms Juglandaceae gehören, mit einer Mühle oder dergleichen fein zermahlen. Dann werden die zermahlenen Schalen in eine wäßrige Alkalilösung eingetaucht und mit einem Alkaliwasser extrahiert.

Als nächstes wird eine passende Säure, wie Essigsäure oder dergleichen zum Neutralisieren zu der extrahierten Flüssigkeit dazugegeben. Danach werden Salze durch Dialyse, Membrantrennung oder dergleichen herausgezogen und zur gleichen Zeit wird die Mischung durch eine Zentrifugiermaschine oder dergleichen zentrifugiert und die extrahierten Substanzen werden niedergeschlagen oder ausgeschieden. Die Niederschläge werden gefiltert und das Filtrat wird konzentriert. Die resultierende feste Substanz wird trockengefroren, um das pudrige Extrakt wieder zu gewinnen.

Beispiel der Extrahierungsbehandlung

In dem Beispiel werden Schalen von Nüssen, die zum Genus Carya gehören, mit einer Mühle gemahlen und 10 l von 0,85%igem Ammoniakwasser wurde zu 1 kg der gemahlenen Schalen hinzugegeben. Die Mischung wurde 5 Stunden bei 40°C gerührt.

Als nächstes wurde die Flüssigkeit gefiltert und Essigsäure wurde dem Filtrat (9,5 l) hinzugegeben, um den pH-Wert auf 6,5 zu neutralisieren. Nach dem Dialysieren durch eine Dialysemembran wurde die erhaltene Substanz trockengefroren. Als ein Ergebnis kann ein pudriges Extrakt mit einer leicht braunen Farbe erhalten werden. Der Ertrag war 40 g, basierend auf 1 kg der gemahlenen Schalen.

1. Anti-Aidsviraltest mit dem Extrakt

Es werden MT-4 Zellen, eine HTLV-I tragende Zellgruppe a ("cell line") verwendet. Die Anti-HIV-Tests (Wuchern von Zellen oder lebensfähigen Zellen, Lebensfähigkeitsmenge von Zellen, HIV-Antigen positive Menge durch IF) des beschriebenen Extrakts in dem zellfreien Viralinfektionssystem und der Cytotoxizitätstest von HIV-uninfizierten MT-4 Zellen werden wie unten beschrieben durchgeführt.

Hinweise:
IV Aidsvirus
IF Immunfluoreszenz

(1) Zellen, die für die Tests verwendet werden

Zellen für den Test wurden wie folgt hergestellt. MT-4 Zellen wurden in einem RPMI-1640 Medium plus 10%igem Kalbfötusserum kultiviert. Nachdem die Zelldichte auf 60×10⁴ Zählungen/ml eingestellt war, wurden die Zellen zentrifugiert und ein frisches Medium wurde hinzugeführt, um es in zwei gleiche Portionen aufzuteilen. Eine war für den Viralinfektionstest vorgesehen und die andere war für den Cytotoxizitätstest vorgesehen.

(2) Der in den Tests verwendete Virus

HIV (human immunodeficiency viruses) mit einer Zelldichte von 3,4×10⁵ PFU/ml

(3) Verfahren (a) Verfahren für die Virusinfektion

Die Zellen für die Tests, welche in (1) vorbereitet wurden, werden mit einer HIV-Probe aus (2) in m.o.i.=0,002 infiziert. Nachdem zum Absorbieren eine Temperatur von 37°C für eine Stunde beibehalten wurde, wurde wieder eine Zentrifugierung durchgeführt.

Das RPMI-1640 Medium plus 10% des Kalbfötusserum (Kulturmedium) wurde zugeführt, um die entsprechenden Zelldichten der infizierten Zellen bzw. der intakten Zellen auf 60×10⁴ (letztlich 30×10⁴) Zählungen/ml anzupassen.

(b) Verteilung der Zellen

In jedem Hohlraum einer 24-Hohlräume aufweisenden Mikroplatte wurden 0,5 ml der wie in (a) hergestellten infizierten und nicht-infizierten Zellen gefüllt.

(c) Verdünnung und Hinzufügen des Extrakts (Heilmittels)

Die Extraktlösung (Heilmittel) der Erfindung, welche durch Auflösen des Extraktes in PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) in einer Konzentration von 5 mg/ml erhalten wurde, wurde durch Filtern durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,22 µm sterilisiert. Jedoch war das Extrakt nicht völlig aufgelöst, so daß tatsächlich ein Rest zurückblieb. Daher wurde das Filtrieren in Reihenfolge durchgeführt, wobei Filter mit Porengrößen von 0,8; 0,45 und 0,22 µm hintereinander verwendet wurden. Die entsprechenden Lösungen, die aus den auf diese Weise gefilterten Extraktlösungen (Heilmittel) gesammelt wurden, wurden mit dem RPMI-1640-Medium eingestellt, um die Konzentrationen innerhalb der Klammern zu zeigen.
2048 (1020 nach der Einstellung), 1024 (512), 512 (256), 256 (128), 128 (64), 64 (32), 32 (16), 16 (8), 8 (4), 4 (2), 2 (1), 0 (Test Standard)

Aus diesen Lösungen mit diesen Konzentrationen wurden je 0,5 ml genommen, und der 24 Hohlräume aufweisenden Mikroplatte zugeführt, in welche die Zellen verteilt waren und die infizierten und uninfizierten MT-4 Zellen schon durch das Verfahren aus (a) geladen waren, um eine minimale Zelldichte 30×10⁴/ml zu erreichen.

2. Test an HIV-induzierter Cytotoxizität und an Cytotoxizität, welche durch das Extrakt der Erfindung induziert ist.

Lebensfähige Zellen wurden gezählt und die Lebensfähigkeitsrate wurde am 3. und 6. Tag visuell beobachtet. Weiterhin wurde ein Test zum Finden des HIV-spezifischen Antigens am 3. und 6. Tag durchgeführt, wobei indirekte Immunfluoreszenz verwendet wurde.

Die Ergebnisse sind unten in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.

Tabelle 1

Tabelle 2

Hinweis:
Zelle n . . . Die Nummer der gezählten Zellen; wenn dies durch 4+60 gezeigt ist, bedeutet dies 4 tote Zellen und 60 lebensfähige Zellen.
viab Lebensfähigkeit.

(3) Ergebnisse des Tests mit HIV

Die Zellwucherung in der Gruppe, bei der das Extrakt (Heilmittel) der Erfindung zugeführt war (1 bis 256 µg/ml), war fast gleich zu der in der intakten Gruppe ohne Heilmittel (siehe Fig. 1A).

Aufgrund dieser Ergebnisse wird angenommen, daß die Cytotoxizität des Extrakts (Heilmittel) der Erfindung ertrem gering sein würde. Am Tag 6 nach der Inkubation waren die HIV-infizierten Zellen fast getötet, aber in der Gruppe, bei der das Extrakt (Heilmittel) der Erfindung zugeführt war (64 bis 512 µg/ml) waren die meisten Zellen am Leben (60 bis 90% der nicht-infizierten Zellen waren am Leben) (siehe Fig. 2A und B). Weiterhin war am Tag 6 nach der Inkubation die Frequenz der HIV-antigen positiven Zellen 90% in der heilmittelfreien Kontrollgruppe, aber in der Gruppe, bei der das Extrakt (Heilmittel) der Erfindung zugeführt war (128 µg/ml oder mehr), waren die viralantigen-positiven Zellen fast negativ (0,2% oder weniger) (siehe Fig. 2C). Aus den vorhergehenden experimentellen Ergebnissen wurde bewiesen, daß die Verwendung des Extrakts gemäß der Erfindung als ein Heilmittel in einer Konzentration von 64 bis 512 µg/ml, nachdem es mit PBS verdünnt wurde, einen Anti-HIV-Effekt zeigt.

2. Test auf carcinostatische Aktivität

Als nächstes wurde das puderige Extrakt, welches durch das Beispiel erhalten wurde, im Hinblick auf seine carcinostatische Aktivität als ein Heilmittel, wie unten beschrieben, untersucht.

(a) Präparation von krebstragenden Mäusen

Sarcoma 180 Zellen werden 5 Wochen alten ICR-Mäusen, die ungefähr 25 g wiegen, intraperitoneal verabreicht, und zwar in einer Dosis von 1×10⁶, um krebstragende Mäuse zu präparieren.

(b) Präparation einer Injektion aus dem Extrakt

In 5 ml einer physiologischen Salzlösung wurden 5 mg des puderigen Extrakts aufgelöst. Die Lösung wurde durch einen milliporigen Filter zur Sterilisation gefiltert, um eine Injektion A herzustellen. Die Injektion A wurde 10fach mit physiologischer Salzlösung verdünnt, um Injektion B herzustellen.

(c) Verfahren zum Bestimmen eines carcinostatischen Effekts

Die Injektion A bzw. B (oben beschrieben) und physiologische Salzlösung als eine Kontrolle wurden der in (a) präparierten krebstragenden Maus intraperitoneal verabreicht, und zwar in einer Dosis von 0,2 ml. Die Anzahl der Tage, die die Maus überlebte und die Anzahl der lebenden Mäuse wurden gezählt.

(d) Ergebnisse der carcinostatischen Aktivität

Die Anzahl der lebenden Mäuse und die Anzahl der Tage, die die Mäuse überlebten, sind auf der Ordinate bzw. auf der Abszisse gezeigt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.

Aus der Figur wird die gesamte Anzahl der Überlebenstage jeweils wie folgt gezählt. In der Gruppe, in der physiologische Salzlösung verabreicht wurde, der Gruppe, in der Injektion A verabreicht wurde und der Gruppe, in der Injektion B verabreicht wurde.

Die Gruppe, in der physiologische Salzlösung verabreicht wurde=
(1×15)+(1×16)+(1×17)+(3×18)+ (3×19)+(1×120)=179

Die Gruppe, in der Injektion A verabreicht wurde=
(1×17)+(2×19)+(2×20)+(1×25)+ (1×30)+(3×60)=330

Die Gruppe, in der Injektion B verabreicht wurde=
(1×19)+(2×20)+(1×22)+(1×25)+ (1×33)+(4×66)=379

Wie oben beschrieben, war die Anzahl der Überlebenstage 17,9 Tage in der Gruppe, in der physiologische Salzlösung verabreicht wurde, 33,0 Tage in der Gruppe, in der Injektion A verabreicht wurde und 37,9 Tage in der Gruppe, in der Injektion B verabreicht wurde. Die Ergebnisse offenbaren, daß das Extrakt (Heilmittel) gemäß der Erfindung eine wirksame carcinostatische Aktivität zeigt.

Während die Erfindung detailliert und in bezug auf ein spezifisches Ausführungsbeispiel beschrieben wurde, ist es dem Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen darin gemacht werden können, ohne von dem Gedanken und dem Bereich der Erfindung abzuweichen.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß Anti-Aidsviralagens und Anti-Krebsagens die als ein wirksames Bestandteil in dem Extrakt, Polysaccharide aus Nußschalen von Nüssen, die zum Genus Juglans oder dem Genus Carya des Angiosperms Juglandaceae gehört, mit einer wäßrigen Alkalilösung aufweist. Das Extrakt hat einen Anti-HIV-Effekt bei einer Konzentration, die sich von 64 bis 512 µg/ml erstreckt und zeigt eine erhöhte Lebensspanne bei Tieren.

Claims

Anti-Aidsviralagens und Anti-Krebsagens die als ein wirksamen Bestandteil in dem Extrakt, Polysaccharide von Nußschalen von Nüssen, die zum Genus Juglans oder dem Genus Carya des Angiosperms Juglandaceae gehört, mit einer wäßrigen Alkali lösung aufweist.